2 × Pfu PCR keverék

A-1 sablon

■ A sablon fehérje -szennyeződéseket vagy Taq -inhibitorokat stb. Tartalmaz - Tisztítsa meg a DNS -templátot, távolítsa el a fehérje -szennyeződéseket, vagy vonja ki a DNS -t a tisztító készletekkel.

■ A sablon denaturálása nem teljes - —Megfelelően növelje a denaturálási hőmérsékletet és hosszabbítsa meg a denaturálási időt.

■ Sablonromlás-Készítse elő újra a sablont.

A-2 Alapozó

■ Rossz minőségű alapozók — Újra szintetizálja a primert.

■ Az alapozó lebomlása - A nagy koncentrációjú primereket a tartósítás érdekében kis térfogatban kell alikvotálni. Kerülje a többszörös fagyasztást és felolvasztást, vagy a tartós, 4 ° C-os fagyasztást.

■ Az alapozók nem megfelelő kialakítása (pl. Nem elegendő az alapozó hossza, dimer képződött az alapozók között stb.) -Az alapozók újratervezése (kerülje az alapozó dimer és a másodlagos szerkezet kialakulását)

A-3 Mg²⁺koncentráció

■ Mg²⁺ a koncentráció túl alacsony —— Megfelelően növelje a Mg -t²⁺ koncentráció: Optimalizálja a Mg -t²⁺ Az optimális Mg meghatározásához 1 mM -tól 3 mM -ig terjedő reakciókoncentrációval végezzük a koncentrációt²⁺ koncentráció minden sablon és primer esetében.

A-4 Lángolási hőmérséklet

■ A magas lágyítási hőmérséklet befolyásolja az alapozó és a sablon kötését. - Csökkentse a lágyítási hőmérsékletet, és optimalizálja az állapotot 2 ° C -os gradienssel.

A-5 Hosszabbítási idő

■ Rövid hosszabbítási idő - A hosszabbítási idő növelése.

Jelenségek: A negatív minták a célszekvencia -sávokat is mutatják.

A-1 A PCR szennyeződése

■ A célszekvencia vagy az amplifikációs termékek keresztszennyeződése - Óvatosan ne pipettázza a célszekvenciát tartalmazó mintát a negatív mintába, és ne öntse ki a centrifugacsőből. A reagenseket vagy berendezéseket autoklávozni kell a meglévő nukleinsavak eltávolítása érdekében, és a szennyeződés meglétét negatív kontroll kísérletekkel kell meghatározni.

■ A reagens szennyeződése —— A reagenseket alikvotálja és alacsony hőmérsékleten tárolja.

A-2 Primer

■ Mg²⁺ a koncentráció túl alacsony —— Megfelelően növelje a Mg -t²⁺ koncentráció: Optimalizálja a Mg -t²⁺ Az optimális Mg meghatározásához 1 mM -tól 3 mM -ig terjedő reakciókoncentrációval végezzük a koncentrációt²⁺ koncentráció minden sablon és primer esetében.

■ A primer helytelen kialakítása és a célszekvencia homológiája a nem célszekvenciával. -Újratervezett alapozók.

Jelenségek: A PCR amplifikációs sávok nincsenek összhangban a várt mérettel, legyen az nagy vagy kicsi, vagy néha mind specifikus amplifikációs sávok, mind nem specifikus amplifikációs sávok előfordulnak.

A-1 Alapozó

■ Gyenge primer specificitás

-Újratervezett alapozó.

■ A primer koncentrációja túl magas —— Megfelelően emelje a denaturálási hőmérsékletet és hosszabbítsa meg a denaturálási időt.

A-2 Mg²⁺ koncentráció

■ Az Mg²⁺ a koncentráció túl magas —— Megfelelően csökkentse az Mg2+ koncentrációt: Optimalizálja a Mg -t²⁺ Az optimális Mg meghatározásához 1 mM -tól 3 mM -ig terjedő reakciókoncentrációval végezzük a koncentrációt²⁺ koncentráció minden sablon és primer esetében.

A-3 Hőstabil polimeráz

■ Túlzott enzimmennyiség —— Csökkentse megfelelően az enzimmennyiséget 0,5 U időközönként.

A-4 Lángolási hőmérséklet

■ A lágyítási hőmérséklet túl alacsony--Megfelelően növelje a lágyítási hőmérsékletet, vagy alkalmazza a kétlépcsős hőkezelési módszert

A-5 PCR ciklus

■ Túl sok PCR ciklus - Csökkentse a PCR ciklusok számát.

A-1 Alapozó—— gyenge specifitás —— tervezze újra az alapozót, változtassa meg az alapozó helyzetét és hosszát annak fokozása érdekében; vagy végezzen beágyazott PCR -t.

A-2 sablon DNS

——A sablon nem tiszta —— Tisztítsa meg a sablont, vagy vonjon ki DNS -t tisztító készletekkel.

A-3 Mg²⁺ koncentráció

- Mg²⁺ a koncentráció túl magas —— Megfelelően csökkentse a Mg -t²⁺ koncentráció: Optimalizálja a Mg -t²⁺ Az optimális Mg meghatározásához 1 mM -tól 3 mM -ig terjedő reakciókoncentrációval végezzük a koncentrációt²⁺ koncentráció minden sablon és primer esetében.

A-4 dNTP

——A dNTP -k koncentrációja túl magas —- Csökkentse megfelelően a dNTP koncentrációját

A-5 Lángolási hőmérséklet

——Túl alacsony lágyítási hőmérséklet —- Megfelelően növelje a lágyítási hőmérsékletet

A-6 Ciklusok

——Túl sok ciklus ——Optimalizálja a ciklusszámot

Az első lépés a megfelelő polimeráz kiválasztása. A hagyományos Taq polimeráz nem képes lektorálni a 3'-5 'exonukleáz aktivitás hiánya miatt, és az eltérés nagymértékben csökkenti a fragmensek kiterjesztési hatékonyságát. Ezért a hagyományos Taq polimeráz nem képes hatékonyan felerősíteni az 5 kb -nál nagyobb célfragmentumokat. A speciális módosítást tartalmazó Taq polimerázt vagy más nagy pontosságú polimerázt kell választani a kiterjesztési hatékonyság javítása és a hosszú fragmentum amplifikáció igényeinek kielégítése érdekében. Ezen túlmenően, a hosszú fragmensek amplifikálása megköveteli a megfelelő primer kialakítást, denaturálási időt, hosszabbítási időt, puffer pH-t stb. A sablon károsodásának megelőzése érdekében a denaturálódási időt 94 ° C -on ciklusonként 30 másodpercre vagy kevesebbre kell csökkenteni, és a hőmérséklet 94 ° C -ra történő felemelkedésének ideje az amplifikáció előtt kevesebb, mint 1 perc. Ezenkívül, ha a kiterjesztési hőmérsékletet körülbelül 68 ° C -ra állítja, és a meghosszabbítási időt 1 kb/perc sebességnek megfelelően tervezi, akkor biztosíthatja a hosszú fragmensek hatékony amplifikációját.

A PCR -amplifikáció hibaaránya csökkenthető különböző DNS -polimerázok nagy pontosságú használatával. Az összes eddig megtalált Taq DNS -polimeráz közül a Pfu enzim a legalacsonyabb hibaarányú és a legnagyobb hűségű (lásd a mellékelt táblázatot). Az enzimszelektálás mellett a kutatók tovább csökkenthetik a PCR mutáció sebességét a reakciókörülmények optimalizálásával, beleértve a puffer összetételének optimalizálását, a hőstabil polimeráz koncentrációját és a PCR ciklusszám optimalizálását.