TIANSeq RNS Frag/cDNS szintézis modul

Jelenleg a nagy teljesítményű szekvenálási technológia elsősorban a következő generációs szekvenálási technológián alapul. Mivel a következő generációs szekvenálási technológia olvasási ideje korlátozott, a teljes hosszúságú szekvenciát kis töredékkönyvtárakra kell bontani. A különböző szekvenálási kísérletek igényeinek megfelelően általában egy- vagy kétvégű szekvenálást választunk. Jelenleg a következő generációs szekvenáló könyvtár DNS-fragmensei általában 200-800 bp tartományban vannak elosztva.

a) A DNS rossz minőségű, és gátlókat tartalmaz. Használjon kiváló minőségű DNS-mintákat, hogy elkerülje az enzimaktivitás gátlását.

b) A DNS-minta mennyisége nem elegendő, ha PCR-mentes módszert használunk a DNS-könyvtár felépítéséhez. Ha a fragmentált DNS bemenete meghaladja az 50 ng-ot, akkor a könyvtár építési folyamata során szelektíven elvégezhető a PCR-mentes munkafolyamat. Ha a könyvtár példányszáma túl alacsony ahhoz, hogy közvetlenül szekvenálható legyen, a DNS -könyvtár PCR -rel amplifikálható az adapter ligálása után.

c) Az RNS -szennyeződés pontatlan kezdeti DNS -meghatározáshoz vezet RNS -szennyezés létezhet a genomiális DNS tisztítási folyamatában, ami pontatlan DNS -meghatározáshoz és elégtelen DNS -betöltéshez vezethet a könyvtár építése során. Az RNS -t RNázzal kezelve lehet eltávolítani.

A-1

a) Kis töredékek (60 bp-120 bp) jelennek meg A kis töredékek általában adaptertöredékek vagy adapterek által képzett dimerek. Az Agencourt AMPure XP mágneses gyöngyökkel végzett tisztítás hatékonyan eltávolítja ezeket az adapterdarabokat, és biztosítja a szekvenálás minőségét.

b) Nagy fragmensek jelennek meg a könyvtárban PCR amplifikáció után A könyvtár DNS -fragmensének mérete 120 bp -tal nő az adapter ligálása után. Ha a DNS -fragmentum több mint 120 bp -tal növekszik az adapter ligálása után, akkor ezt a túlzott PCR -amplifikáció kóros fragmentum -amplifikációja okozhatja. A PCR ciklusok számának csökkentése megelőzheti a helyzetet.

c) Rendellenes méretű könyvtári DNS -fragmensek az adapter ligálása után Ebben a készletben az adapter hossza 60 bp. Amikor a töredék két végét az adapterekhez kötjük, a hossza csak 120 bp -tal nő. Ha nem a készletben található adaptert használja, kérjük, vegye fel a kapcsolatot a szállítóval, hogy megadja a vonatkozó információkat, például az adapter hosszát. Győződjön meg arról, hogy a kísérlet munkafolyamata és működése követi a kézikönyvben leírt lépéseket.

d) Rendellenes DNS -fragmentum méret az adapter ligálása előtt Ennek a problémának az oka lehet a DNS -fragmentáció során fellépő rossz reakciókörülmények. Különböző reakcióidőt kell használni a különböző DNS -bevitelhez. Ha a DNS bemenet több mint 10 ng, javasoljuk, hogy a 12 perces reakcióidőt válasszuk kiindulási időként az optimalizáláshoz, és az ekkor előállított fragmens mérete főként 300-500 bp tartományban van. A felhasználók saját igényeiknek megfelelően növelhetik vagy csökkenthetik a DNS-fragmensek hosszát 2-4 percig, hogy optimalizálják a szükséges méretű DNS-fragmenseket.

A-2

a) A töredezettségi idő nincs optimalizálva Ha a fragmentált DNS túl kicsi vagy túl nagy, kérjük, olvassa el az utasításban található töredezettségi idő kiválasztására vonatkozó irányelveket a reakcióidő meghatározásához, és használja ezt az időpontot kontrollként, továbbá állítson be egy reakciórendszerrel, hogy meghosszabbítsa vagy lerövidítse a 3 percet, hogy pontosabban állítsa be a fragmentációs időt.

A-3

A DNS kóros méreteloszlása ​​a fragmentációs kezelés után

a) A fragmentációs reagens helytelen felolvasztási módszere, vagy a reagens nincs teljesen összekeveredve a kiolvasztás után. Olvassza fel az 5 × fragmentációs enzimkeverő reagenst jégen. Felolvasztás után keverje össze egyenletesen a reagenst a cső aljának óvatos mozgatásával. Ne forgassa fel a reagenst!

b) A DNS bemeneti minta EDTA -t vagy más szennyező anyagot tartalmaz. A sóionok és kelátképző szerek kimerülése a DNS tisztítási lépésben különösen fontos a kísérlet sikere szempontjából. Ha a DNS -t 1 × TE -ben oldjuk, akkor az utasításban megadott módszerrel végezzük a töredezettséget. Ha az EDTA koncentrációja az oldatban bizonytalan, javasoljuk a DNS tisztítását és ionmentesített vízben való feloldását a későbbi reakcióhoz.

c) Pontatlan kezdeti DNS -meghatározás A töredezett DNS mérete szorosan összefügg a bevitt DNS mennyiségével. A fragmentációs kezelés előtt elengedhetetlen a DNS pontos mennyiségi meghatározása Qubit, Picogreen és más módszerekkel a reakciórendszerben lévő DNS pontos mennyiségének meghatározásához.

 d) A reakciórendszer előkészítése nem követi az utasításokat A töredezett reakciórendszer előkészítését jégen, szigorúan az utasítások szerint kell elvégezni. A legjobb hatás biztosítása érdekében a reakció összes összetevőjét jégre kell helyezni, és a reakciórendszer előkészítését a teljes lehűlés után kell elvégezni. Az előkészítés befejezése után pöccintsen vagy pipettázzon, hogy alaposan összekeveredjen. Ne örvénylje!

1. A nem megfelelő keverési módszer (örvény, heves oszcilláció stb.) A könyvtártöredékek kóros eloszlását idézi elő (amint az a következő ábrán látható), és ez befolyásolja a könyvtár minőségét. Ezért a Fragmentation Mix reakcióoldat elkészítésekor óvatosan pipettázza fel és le a keverést, vagy az ujjhegy segítségével pöccintsen és egyenletesen keverje össze. Ügyeljen arra, hogy ne keverje össze az örvényt.

2. Nagy tisztaságú DNS -t kell használni a könyvtár felépítéséhez

■ Jó DNS -integritás: Az elektroforézis sáv több, mint 30 kb, folt nélkül

■ OD260/230:> 1.5

■ OD260/280: 1,7-1,9

3. A DNS -beviteli mennyiségnek pontosnak kell lennie Javasolt a Qubit és a PicoGreen módszerek használata a DNS mennyiségi meghatározására, nem pedig a Nanodrop.

4. Meg kell határozni az EDTA tartalmát a DNS -oldatban. Az EDTA nagy hatással van a fragmentációs reakcióra. Ha az EDTA -tartalom magas, a DNS -tisztítást el kell végezni a következő vizsgálat előtt.

5. A fragmentációs reakcióoldatot jégen kell elkészíteni. A fragmentálási folyamat érzékeny a reakció hőmérsékletére és idejére (különösen fokozó hozzáadása után). A reakcióidő pontosságának biztosítása érdekében készítse elő a reakciórendszert jégen.

6. A fragmentálási reakcióidőnek pontosnak kell lennie A fragmentációs lépés reakcióideje közvetlenül befolyásolja a fragmentumok méretét, ezáltal befolyásolja a DNS -fragmensek méreteloszlását a könyvtárban.

1. Milyen típusú minta alkalmazható erre a készletre?

Ennek a készletnek a megfelelő mintatípusa lehet teljes RNS vagy tisztított mRNS, jó RNS integritással. Ha teljes RNS -t használnak a könyvtár felépítéséhez, ajánlatos az rRNS -kimerülési készletet (Kat.#4992363/4992364/4992391) használni az rRNS eltávolításához.

2. Használhatók -e FFPE minták könyvtár készítéséhez ezzel a készlettel?

Az FFPE mintákban található mRNS bizonyos mértékben lebomlik, viszonylag gyenge integritással. Ha ezt a készletet használja a könyvtárépítéshez, ajánlott optimalizálni a töredezettség idejét (lerövidíteni a töredezettség idejét, vagy nem végezni töredezettséget).

3. Mi okozhatja a behelyezett szegmens enyhe eltérését a termék kézikönyvében megadott méretválasztási lépéssel?

A méretválasztást a termék kézikönyvében szereplő méretválasztási lépés szigorú betartásával kell elvégezni. Eltérés esetén az lehet az oka, hogy a mágneses gyöngyök nincsenek kiegyensúlyozva szobahőmérsékleten, vagy nincsenek teljesen összekeverve, a pipetta nem pontos, vagy a folyadék a csúcsban maradt. A kísérlethez ajánlott az alacsony adszorpciójú tippeket használni.

4. Adapterek kiválasztása a könyvtárépítésben

A könyvtárépítő készlet nem tartalmaz adapterreagenseket, ezért ajánlott ezt a készletet a TIANSeq egyindexes adapterrel (Illumina) együtt használni (4992641/4992642/4992378).

5. A könyvtár QC -je

Könyvtári kvantitatív észlelés: A könyvtár tömegkoncentrációjának és mólkoncentrációjának meghatározásához Qubit és qPCR használható. A művelet szigorúan összhangban van a termék kézikönyvével. A könyvtár koncentrációja általában megfelel az NGS szekvenálás követelményeinek. Könyvtári terjesztési tartomány észlelése: Az Agilent 2100 Bioanalyzer segítségével észleli a könyvtár elosztási tartományát.

6. Az erősítési ciklus számának kiválasztása

Az utasítások szerint a PCR ciklusok száma 6-12, és a szükséges PCR ciklusok számát a minta bemenetének megfelelően kell kiválasztani. A nagy hozamú könyvtárakban a túlzott amplifikáció általában különböző mértékben fordul elő, ami az Agilent 2100 Bioanalyzer detektálásakor a céltartomány csúcsa utáni valamivel nagyobb csúccsal nyilvánul meg, vagy a Qubit észlelt koncentrációja alacsonyabb, mint a qPCR. Az enyhe túlzott amplifikáció normális jelenség, amely nem befolyásolja a könyvtár szekvenálását és az azt követő adatelemzést.

7. A tüskék az Agilent 2100 Bioanalyzer észlelési profiljában jelennek meg

A tüskék megjelenése az Agilent 2100 Bioanalyzer detektálásban a minták egyenetlen töredezettsége miatt következik be, ahol több fragmentum lesz bizonyos méretben, és ez nyilvánvalóbb lesz a PCR -dúsítás után. Ebben az esetben javasoljuk, hogy ne végezze el a méretválasztást, azaz állítsa a fragmentációs feltételt 94 ° C -ra 15 percig inkubálva, ahol a fragmentum eloszlása ​​kicsi és koncentrált, és javítható a homogenitás.