TIANSeq DirectFast Library Kit (illumina)

A DNS könyvtár építési technológiájának új generációja töredezettség -előkezelés nélkül.

A TIANSeq DirectFast Library Kit (illumina) a DNS könyvtár előkészítő készlet az illumina szekvenáló platformhoz. A készlet egylépéses reakciófolyamatot alkalmaz, amely nem igényel több tisztítási lépést. A DNS-töredezettség, a végjavítás és a dA-kiegyenlítés elvégezhető egy cső enzimatikus reakciójában. A készlet PCR amplifikációs reagensét is kifejezetten úgy optimalizáltuk, hogy biztosítsuk az amplifikációval kapott DNS -szekvencia magas hozamát, jó pontosságát és bázis torzítását.

Macska. Nem Csomagolás mérete
4992259 24 rxn
4992260 96 rxn

Termék leírás

Munkafolyamat

Kísérleti példa

GYIK

Termékcímkék

Jellemzők

■ Jó szekvenálási egységesség: Nincs bázis torzítás a DNS -fragmentációs folyamatban és a PCR -amplifikációs folyamatban.
■ Nagy könyvtári konverziós hatékonyság: a nagy hatékonyságú könyvtárkonstrukció biztosítható 1 ng DNS-mintákhoz.
■ Gyors működés: A teljes könyvtárépítési folyamat mindössze 2,5 órát vesz igénybe.
■ Költséghatékony: nincs szükség speciális műszerekre és berendezésekre.

Leírás

Típus: DNS könyvtár előkészítés illumina nagy teljesítményű szekvenáló platformhoz
Minta: Genomi DNS vagy nagy DNS -töredék
Cél: Kétszálú DNS
Mintabevitel indítása: 1 ng- 1 μg
Működési idő: 2,5 óra
Alábbi alkalmazások: Szekvenálás illumina platformon

Minden termék személyre szabható az ODM/OEM számára. A részletekért,kattintson a Testreszabott szolgáltatás (ODM/OEM) lehetőségre


  • Előző:
  • Következő:

  • product_certificate04 product_certificate01 product_certificate03 product_certificate02
    ×

    Workflow Workflow

    Rugalmas mintabevitel és töredezett méretFlexible sample input and fragmented size 1. ábra Különböző reakcióidők DNS -fragmentációs profiljai. 10 ng és 1000 ng DNS -t fragmentáltunk a TIANSeq DirectFast DNS Library Kit segítségével. A különböző reakcióidővel kezelt reakciótermékeket 1,8x Ampure XP mágneses gyöngyökkel tisztítottuk, és az Angilent 2100 analízissel analizáltuk.
    Covaris-szerű szekvenáló lefedettségCovaris-Like Sequencing Coverage 2. ábra A különböző könyvtári előkészítési módszerek genomlefedettségének összehasonlítása. Három különböző GC tartalmú bakteriális genomiális DNS -t keverünk ekvimolárisan, és összehasonlítjuk a 100 ng kevert DNS -könyvtár szekvenálási genom lefedettségét ezekkel a módszerekkel. Az eredmények azt mutatják, hogy a TIANSeq DirectFast Library Kit ugyanolyan hatással van a DNS -töredezettségre, mint a mechanikus nyírás, és nincs töredezettség a töredezettséghez.
    Nincs szisztematikus torzítás már 1 ng bemeneti DNS eseténNo Systematic Bias for As Low As 1 ng Input DNA 3. ábra A különböző könyvtári előkészítési módszerek genomlefedettségének összehasonlítása. Három, különböző GC -tartalmú bakteriális genomiális DNS -t keverünk ekvimolárisan, és összehasonlítjuk az ezekkel a módszerekkel 1 ng vegyes DNS -könyvtárak szekvenáló genom lefedettségét. Az eredmények azt mutatják, hogy a TIANSeq DirectFast Library Kit konzisztens töredezettségi hatást fejt ki a mechanikus nyírással, még 1 ng -os DNS -bevitel esetén is, és nincs bázis -torzítás.
    Képes PCR-mentes munkafolyamatra

    Capable of PCR-Free Workflow

    4. ábra: A genomiális DNS különböző bemeneteit használtuk fel a könyvtár PCR vagy PCR-mentes könyvtári konstrukcióval történő összeállításához, és összehasonlítottuk a genom lefedettségét. Az eredmények azt mutatják, hogy az egycsöves működés és a hatékony könyvtárépítési lépések révén a TIANSeq DirectFast Library Kit segítségével felépített DNS-könyvtár magas konzisztenciát mutat a mechanikus nyírással a fragmensszekvencia-lefedettség eloszlásában mind a PCR-dúsítás PCR-mentes munkafolyamat során.
     A könyvtárépítés hatékonyságának és hozamának statisztikájaStatistics of Library Construction Efficiency and Yield 5. ábra A könyvtári DNS kvantitatív elemzésének eredményei, amelyeket qPCR módszerrel nyertünk a könyvtár felépítése után, PCR-mentes módszerrel, különböző kiindulási mennyiségű (1, 10, 25, 50, 100, 500, 1000 ng) minták esetében. A lineáris regressziós elemzés azt mutatja, hogy a könyvtár hozama jó lineáris összefüggéssel rendelkezik a széles mintabeviteli tartományban. Már 1 ng DNS -bevitel esetén a könyvtárépítés hatékonysága nem csökken.

    Különböző termékek szekvenálási adatainak összehasonlítása

    Comparison of Sequencing Data of Different Products

    K: Mi a töredékméret általános eloszlása ​​az NGS könyvtárban?

    Jelenleg a nagy teljesítményű szekvenálási technológia elsősorban a következő generációs szekvenálási technológián alapul. Mivel a következő generációs szekvenálási technológia olvasási ideje korlátozott, a teljes hosszúságú szekvenciát kis töredékkönyvtárakra kell bontani. A különböző szekvenálási kísérletek igényeinek megfelelően általában egy- vagy kétvégű szekvenálást választunk. Jelenleg a következő generációs szekvenáló könyvtár DNS-fragmensei általában 200-800 bp tartományban vannak elosztva.

    excel
    K: A felépített könyvtár DNS -koncentrációja alacsony.

    a) A DNS rossz minőségű, és gátlókat tartalmaz. Használjon kiváló minőségű DNS-mintákat, hogy elkerülje az enzimaktivitás gátlását.

    b) A DNS-minta mennyisége nem elegendő, ha PCR-mentes módszert használunk a DNS-könyvtár felépítéséhez. Ha a fragmentált DNS bemenete meghaladja az 50 ng-ot, akkor a könyvtár építési folyamata során szelektíven elvégezhető a PCR-mentes munkafolyamat. Ha a könyvtár példányszáma túl alacsony ahhoz, hogy közvetlenül szekvenálható legyen, a DNS -könyvtár PCR -rel amplifikálható az adapter ligálása után.

    c) Az RNS -szennyeződés pontatlan kezdeti DNS -meghatározáshoz vezet RNS -szennyezés létezhet a genomiális DNS tisztítási folyamatában, ami pontatlan DNS -meghatározáshoz és elégtelen DNS -betöltéshez vezethet a könyvtár építése során. Az RNS -t RNázzal kezelve lehet eltávolítani.

    K: A DNS -könyvtár abnormális sávokat mutatott az elektroforézis elemzésében.

    A-1

    a) Kis töredékek (60 bp-120 bp) jelennek meg A kis töredékek általában adaptertöredékek vagy adapterek által képzett dimerek. Az Agencourt AMPure XP mágneses gyöngyökkel végzett tisztítás hatékonyan eltávolítja ezeket az adapterdarabokat, és biztosítja a szekvenálás minőségét.

    b) Nagy fragmensek jelennek meg a könyvtárban PCR amplifikáció után A könyvtár DNS -fragmensének mérete 120 bp -tal nő az adapter ligálása után. Ha a DNS -fragmentum több mint 120 bp -tal növekszik az adapter ligálása után, akkor ezt a túlzott PCR -amplifikáció kóros fragmentum -amplifikációja okozhatja. A PCR ciklusok számának csökkentése megelőzheti a helyzetet.

    c) Rendellenes méretű könyvtári DNS -fragmensek az adapter ligálása után Ebben a készletben az adapter hossza 60 bp. Amikor a töredék két végét az adapterekhez kötjük, a hossza csak 120 bp -tal nő. Ha nem a készletben található adaptert használja, kérjük, vegye fel a kapcsolatot a szállítóval, hogy megadja a vonatkozó információkat, például az adapter hosszát. Győződjön meg arról, hogy a kísérlet munkafolyamata és működése követi a kézikönyvben leírt lépéseket.

    d) Rendellenes DNS -fragmentum méret az adapter ligálása előtt Ennek a problémának az oka lehet a DNS -fragmentáció során fellépő rossz reakciókörülmények. Különböző reakcióidőt kell használni a különböző DNS -bevitelhez. Ha a DNS bemenet több mint 10 ng, javasoljuk, hogy a 12 perces reakcióidőt válasszuk kiindulási időként az optimalizáláshoz, és az ekkor előállított fragmens mérete főként 300-500 bp tartományban van. A felhasználók saját igényeiknek megfelelően növelhetik vagy csökkenthetik a DNS-fragmensek hosszát 2-4 percig, hogy optimalizálják a szükséges méretű DNS-fragmenseket.

    A-2

    a) A töredezettségi idő nincs optimalizálva Ha a fragmentált DNS túl kicsi vagy túl nagy, kérjük, olvassa el az utasításban található töredezettségi idő kiválasztására vonatkozó irányelveket a reakcióidő meghatározásához, és használja ezt az időpontot kontrollként, továbbá állítson be egy reakciórendszerrel, hogy meghosszabbítsa vagy lerövidítse a 3 percet, hogy pontosabban állítsa be a fragmentációs időt.

    A-3

    A DNS kóros méreteloszlása ​​a fragmentációs kezelés után

    a) A fragmentációs reagens helytelen felolvasztási módszere, vagy a reagens nincs teljesen összekeveredve a kiolvasztás után. Olvassza fel az 5 × fragmentációs enzimkeverő reagenst jégen. Felolvasztás után keverje össze egyenletesen a reagenst a cső aljának óvatos mozgatásával. Ne forgassa fel a reagenst!

    b) A DNS bemeneti minta EDTA -t vagy más szennyező anyagot tartalmaz. A sóionok és kelátképző szerek kimerülése a DNS tisztítási lépésben különösen fontos a kísérlet sikere szempontjából. Ha a DNS -t 1 × TE -ben oldjuk, akkor az utasításban megadott módszerrel végezzük a töredezettséget. Ha az EDTA koncentrációja az oldatban bizonytalan, javasoljuk a DNS tisztítását és ionmentesített vízben való feloldását a későbbi reakcióhoz.

    c) Pontatlan kezdeti DNS -meghatározás A töredezett DNS mérete szorosan összefügg a bevitt DNS mennyiségével. A fragmentációs kezelés előtt elengedhetetlen a DNS pontos mennyiségi meghatározása Qubit, Picogreen és más módszerekkel a reakciórendszerben lévő DNS pontos mennyiségének meghatározásához.

     d) A reakciórendszer előkészítése nem követi az utasításokat A töredezett reakciórendszer előkészítését jégen, szigorúan az utasítások szerint kell elvégezni. A legjobb hatás biztosítása érdekében a reakció összes összetevőjét jégre kell helyezni, és a reakciórendszer előkészítését a teljes lehűlés után kell elvégezni. Az előkészítés befejezése után pöccintsen vagy pipettázzon, hogy alaposan összekeveredjen. Ne örvénylje!

    K: Fontos megjegyzések a TIANSeq DirectFast DNS Library Kit (Illumina) csomaghoz (4992259/4992260)

    1. A nem megfelelő keverési módszer (örvény, heves oszcilláció stb.) A könyvtártöredékek kóros eloszlását idézi elő (amint az a következő ábrán látható), és ez befolyásolja a könyvtár minőségét. Ezért a Fragmentation Mix reakcióoldat elkészítésekor óvatosan pipettázza fel és le a keverést, vagy az ujjhegy segítségével pöccintsen és egyenletesen keverje össze. Ügyeljen arra, hogy ne keverje össze az örvényt.

    excel

    2. Nagy tisztaságú DNS -t kell használni a könyvtár felépítéséhez

    ■ Jó DNS -integritás: Az elektroforézis sáv több, mint 30 kb, folt nélkül

    ■ OD260/230:> 1.5

    ■ OD260/280: 1,7-1,9

    3. A DNS -beviteli mennyiségnek pontosnak kell lennie Javasolt a Qubit és a PicoGreen módszerek használata a DNS mennyiségi meghatározására, nem pedig a Nanodrop.

    4. Meg kell határozni az EDTA tartalmát a DNS -oldatban. Az EDTA nagy hatással van a fragmentációs reakcióra. Ha az EDTA -tartalom magas, a DNS -tisztítást el kell végezni a következő vizsgálat előtt.

    5. A fragmentációs reakcióoldatot jégen kell elkészíteni. A fragmentálási folyamat érzékeny a reakció hőmérsékletére és idejére (különösen fokozó hozzáadása után). A reakcióidő pontosságának biztosítása érdekében készítse elő a reakciórendszert jégen.

    6. A fragmentálási reakcióidőnek pontosnak kell lennie A fragmentációs lépés reakcióideje közvetlenül befolyásolja a fragmentumok méretét, ezáltal befolyásolja a DNS -fragmensek méreteloszlását a könyvtárban.

    K: Fontos megjegyzések a TIANSeq Fast RNA Library Kit (Illumina) csomaghoz (4992375/4992376)

    1. Milyen típusú minta alkalmazható erre a készletre?

    Ennek a készletnek a megfelelő mintatípusa lehet teljes RNS vagy tisztított mRNS, jó RNS integritással. Ha teljes RNS -t használnak a könyvtár felépítéséhez, ajánlatos az rRNS -kimerülési készletet (Kat.#4992363/4992364/4992391) használni az rRNS eltávolításához.

    2. Használhatók -e FFPE minták könyvtár készítéséhez ezzel a készlettel?

    Az FFPE mintákban található mRNS bizonyos mértékben lebomlik, viszonylag gyenge integritással. Ha ezt a készletet használja a könyvtárépítéshez, ajánlott optimalizálni a töredezettség idejét (lerövidíteni a töredezettség idejét, vagy nem végezni töredezettséget).

    3. Mi okozhatja a behelyezett szegmens enyhe eltérését a termék kézikönyvében megadott méretválasztási lépéssel?

    A méretválasztást a termék kézikönyvében szereplő méretválasztási lépés szigorú betartásával kell elvégezni. Eltérés esetén az lehet az oka, hogy a mágneses gyöngyök nincsenek kiegyensúlyozva szobahőmérsékleten, vagy nincsenek teljesen összekeverve, a pipetta nem pontos, vagy a folyadék a csúcsban maradt. A kísérlethez ajánlott az alacsony adszorpciójú tippeket használni.

    4. Adapterek kiválasztása a könyvtárépítésben

    A könyvtárépítő készlet nem tartalmaz adapterreagenseket, ezért ajánlott ezt a készletet a TIANSeq egyindexes adapterrel (Illumina) együtt használni (4992641/4992642/4992378).

    5. A könyvtár QC -je

    Könyvtári kvantitatív észlelés: A könyvtár tömegkoncentrációjának és mólkoncentrációjának meghatározásához Qubit és qPCR használható. A művelet szigorúan összhangban van a termék kézikönyvével. A könyvtár koncentrációja általában megfelel az NGS szekvenálás követelményeinek. Könyvtári terjesztési tartomány észlelése: Az Agilent 2100 Bioanalyzer segítségével észleli a könyvtár elosztási tartományát.

    6. Az erősítési ciklus számának kiválasztása

    Az utasítások szerint a PCR ciklusok száma 6-12, és a szükséges PCR ciklusok számát a minta bemenetének megfelelően kell kiválasztani. A nagy hozamú könyvtárakban a túlzott amplifikáció általában különböző mértékben fordul elő, ami az Agilent 2100 Bioanalyzer detektálásakor a céltartomány csúcsa utáni valamivel nagyobb csúccsal nyilvánul meg, vagy a Qubit észlelt koncentrációja alacsonyabb, mint a qPCR. Az enyhe túlzott amplifikáció normális jelenség, amely nem befolyásolja a könyvtár szekvenálását és az azt követő adatelemzést.

    7. A tüskék az Agilent 2100 Bioanalyzer észlelési profiljában jelennek meg

    A tüskék megjelenése az Agilent 2100 Bioanalyzer detektálásban a minták egyenetlen töredezettsége miatt következik be, ahol több fragmentum lesz bizonyos méretben, és ez nyilvánvalóbb lesz a PCR -dúsítás után. Ebben az esetben javasoljuk, hogy ne végezze el a méretválasztást, azaz állítsa a fragmentációs feltételt 94 ° C -ra 15 percig inkubálva, ahol a fragmentum eloszlása ​​kicsi és koncentrált, és javítható a homogenitás.

    Írja ide üzenetét, és küldje el nekünk