Blood Direct PCR készlet

A célgén gyors amplifikációja közvetlenül, vért használva sablonként extrahálás nélkül.

Ez a készlet genetikailag módosított anti-inhibitor DNS polimerázt alkalmaz, hogy hatékonyan felerősítse az egypéldányos géneket az emberi genomban. A készlet jól optimalizált pufferrendszere segít a polimeráznak erőteljesen ellenállni a PCR -inhibitorok gátlásának, így közvetlenül képes amplifikálni a DNS -t vér és tenyésztett sejtek segítségével. Ez a termék könnyen kezelhető, és nem igényel bonyolult lépéseket, például DNS -tisztítást vagy minta -előkezelést.
Ez a készlet 2 × MasterMix -ként kerül forgalomba, és a reakció egyszerűen elvégezhető a vér -sablon és a megfelelő detektáló primerek hozzáadásával. Alkalmazható emlősök, például emberek, egerek, sertések, szarvasmarha és más fajok tenyésztett sejtjein, valamint friss vagy 4 ° C -os mélyhűtésű teljes vér, véralvadásgátló (EDTA, citrát, heparin), cseppfolyósított vérrögök és száraz vérfoltok Whatman 903 és FTA Elute kereskedelmi kártyákon tárolják.

Macska. Nem	Csomagolás mérete
4992529	20 µl × 100 rxn
4992530	20 µl × 500 rxn

Küldjön e -mailt nekünk

Termék leírás

Kísérleti példa

GYIK

Termékcímkék

Jellemzők

■ Egyszerű és gyors: a PCR -amplifikáció közvetlenül elvégezhető vér felhasználásával sablonként, a minta előkészítésének és a DNS -kivonásnak az unalmas lépései nélkül.
■ Nagy tisztaság: A minta előkezelési és DNS-kivonási lépéseinek kihagyása segít elkerülni a minták keresztfertőzését.
■ Nagy áteresztőképesség: A nagyméretű minták PCR azonosítása elvégezhető a készlet 96/384 lyukú PCR lemezekkel való kombinálásával.
■ Erős egyetemesség: Ez a készlet hatékonyan képes erősíteni a magas GC -töredékeket vagy a bonyolult másodlagos szerkezetű fragmentumokat, és az amplifikációs hossza akár 5 kb is lehet.
■ Erős stresszállóság: Ez a készlet különböző fajokra és különböző módon megőrzött vérmintákra alkalmazható.

Alkalmazások

A készlet PCR termékei „A” betűt tartalmaznak a 3′-végén, amely közvetlenül felhasználható TA vektor klónozására. Ez a készlet használható genomi DNS-fragmensek amplifikálására, nagy teljesítményű genetikai elemzésre és genotipizálásra (például géndetektálás).

Minden termék személyre szabható az ODM/OEM számára. A részletekért,kattintson a Testreszabott szolgáltatás (ODM/OEM) lehetőségre

Előző: TIANcombi DNS Lyse & Det PCR készlet

Következő: Egérszövet közvetlen PCR készlet

	A humán EDTA antikoagulációt alkalmazva sablonként 4 különböző GC tartalmú gént amplifikáltunk a Blood Direct PCR Kit segítségével. A PCR reakciórendszer 20 μl volt, és 1 μl vért használtunk templátként. M: TIANGEN Marker II; 1: Töredék mérete 1090 bp, GC -tartalom 68,1%; 2: Töredék mérete 1915 bp, GC -tartalom 70,4%; 3: Töredék mérete 448 bp, GC -tartalom 74,8%; 4: Töredék mérete 1527 bp, GC -tartalom 61,5%. Kísérleti eredmények: A Blood Direct PCR Kit hatékonyan képes amplifikálni a 61,5%-74,8%közötti GC-tartalmú DNS-fragmenseket, ami arra utal, hogy képes magas GC-fragmentumok amplifikálására.
	A humán EDTA antikoagulációt alkalmazva sablonként 5 különböző hosszúságú gént (ActB, Prp, DN1.0, Hn2.0 és Hn4.0) amplifikáltunk a Blood Direct PCR Kit segítségével. A PCR reakciórendszer 20 μl volt, és 1 μl vért használtunk templátként. M: TIANGEN Marker II; 1-3: 3 különböző vérminták; NTC: szabályozás primerek nélkül. Kísérleti eredmények: A Blood Direct PCR Kit képes akár 4 kb hosszúságú fragmenseket is felerősíteni, ami arra utal, hogy képes hosszú fragmensek amplifikálására.
	Emberi EDTA antikoagulációt használva sablonként a Blood Direct PCR készletet használták különböző vérminták PCR kimutatására. A PCR reakciórendszer 20 μl volt, és 1 μl vért használtunk templátként. M: TIANGEN Marker II; 1-9: a vér töltőmennyisége 0,1 μl, 0,2 μl, 0,3 μl, 0,4 μl, 1 μl, 2 μl, 3 μl, 4 μl és 5 μl; NTC: vezérlés sablon nélkül Kísérleti eredmények: A Blood Direct PCR Kit erősen ellenáll a vérnek, és 0,1-5 μl terhelési tartományban képes felerősíteni a vérmintákat.
	Sablonként emberi, patkány, csirke és más fajok vérmintáit használták különböző kezelésekkel. A Blood Direct PCR készletet a PRNP (humán, 750 bp), az aktin (patkány, 200 bp) és a β-aktin (csirke, 1,0 kb) amplifikálására használtuk. A PCR reakciórendszer 20 μl volt, és 1 μl vért használtunk templátként. M: TIANGEN Marker II. Kísérleti eredmények: A Blood Direct PCR készlet sokféle mintára alkalmazható, és a közvetlen PCR kimutatás elvégezhető különböző fajok vérmintáin, különböző kezelésekkel.

K: Nincs erősítő sáv

A-1 sablon

■ A sablon fehérje -szennyeződéseket vagy Taq -inhibitorokat stb. Tartalmaz - Tisztítsa meg a DNS -templátot, távolítsa el a fehérje -szennyeződéseket, vagy vonja ki a DNS -t a tisztító készletekkel.

■ A sablon denaturálása nem teljes - —Megfelelően növelje a denaturálási hőmérsékletet és hosszabbítsa meg a denaturálási időt.

■ Sablonromlás-Készítse elő újra a sablont.

A-2 Alapozó

■ Rossz minőségű alapozók — Újra szintetizálja a primert.

■ Az alapozó lebomlása - A nagy koncentrációjú primereket a tartósítás érdekében kis térfogatban kell alikvotálni. Kerülje a többszörös fagyasztást és felolvasztást, vagy a tartós, 4 ° C-os fagyasztást.

■ Az alapozók nem megfelelő kialakítása (pl. Nem elegendő az alapozó hossza, dimer képződött az alapozók között stb.) -Az alapozók újratervezése (kerülje az alapozó dimer és a másodlagos szerkezet kialakulását)

A-3 Mg²⁺koncentráció

■ Mg²⁺ a koncentráció túl alacsony —— Megfelelően növelje a Mg -t²⁺koncentráció: Optimalizálja a Mg -t²⁺ Az optimális Mg meghatározásához 1 mM -tól 3 mM -ig terjedő reakciókoncentrációval végezzük a koncentrációt²⁺ koncentráció minden sablon és primer esetében.

A-4 Lángolási hőmérséklet

■ A magas lágyítási hőmérséklet befolyásolja az alapozó és a sablon kötését. - Csökkentse a lágyítási hőmérsékletet, és optimalizálja az állapotot 2 ° C -os gradienssel.

A-5 Hosszabbítási idő

■ Rövid hosszabbítási idő - A hosszabbítási idő növelése.

K: Hamis pozitív

Jelenségek: A negatív minták a célszekvencia -sávokat is mutatják.

A-1 A PCR szennyeződése

■ A célszekvencia vagy az amplifikációs termékek keresztszennyeződése - Óvatosan ne pipettázza a célszekvenciát tartalmazó mintát a negatív mintába, és ne öntse ki a centrifugacsőből. A reagenseket vagy berendezéseket autoklávozni kell a meglévő nukleinsavak eltávolítása érdekében, és a szennyeződés meglétét negatív kontroll kísérletekkel kell meghatározni.

■ A reagens szennyeződése —— A reagenseket alikvotálja és alacsony hőmérsékleten tárolja.

A-2 Primer

■ Mg²⁺ a koncentráció túl alacsony —— Megfelelően növelje a Mg -t²⁺ koncentráció: Optimalizálja a Mg -t²⁺ Az optimális Mg meghatározásához 1 mM -tól 3 mM -ig terjedő reakciókoncentrációval végezzük a koncentrációt²⁺ koncentráció minden sablon és primer esetében.

■ A primer helytelen kialakítása és a célszekvencia homológiája a nem célszekvenciával. -Újratervezett alapozók.

K: Nem specifikus erősítés

Jelenségek: A PCR amplifikációs sávok nincsenek összhangban a várt mérettel, legyen az nagy vagy kicsi, vagy néha mind specifikus amplifikációs sávok, mind nem specifikus amplifikációs sávok előfordulnak.

A-1 Alapozó

■ Gyenge primer specificitás

-Újratervezett alapozó.

■ A primer koncentrációja túl magas —— Megfelelően emelje a denaturálási hőmérsékletet és hosszabbítsa meg a denaturálási időt.

A-2 Mg²⁺ koncentráció

■ Az Mg²⁺ a koncentráció túl magas —— Megfelelően csökkentse az Mg2+ koncentrációt: Optimalizálja a Mg -t²⁺ Az optimális Mg meghatározásához 1 mM -tól 3 mM -ig terjedő reakciókoncentrációval végezzük a koncentrációt²⁺ koncentráció minden sablon és primer esetében.

A-3 Hőstabil polimeráz

■ Túlzott enzimmennyiség —— Csökkentse megfelelően az enzimmennyiséget 0,5 U időközönként.

A-4 Lángolási hőmérséklet

■ A lágyítási hőmérséklet túl alacsony--Megfelelően növelje a lágyítási hőmérsékletet, vagy alkalmazza a kétlépcsős hőkezelési módszert

A-5 PCR ciklus

■ Túl sok PCR ciklus - Csökkentse a PCR ciklusok számát.

K: Foltos vagy elkenődő szalagok

A-1 Alapozó—— gyenge specifitás —— tervezze újra az alapozót, változtassa meg az alapozó helyzetét és hosszát annak fokozása érdekében; vagy végezzen beágyazott PCR -t.

A-2 sablon DNS

——A sablon nem tiszta —— Tisztítsa meg a sablont, vagy vonjon ki DNS -t tisztító készletekkel.

A-3 Mg²⁺ koncentráció

- Mg²⁺ a koncentráció túl magas —— Megfelelően csökkentse a Mg -t²⁺ koncentráció: Optimalizálja a Mg -t²⁺ Az optimális Mg meghatározásához 1 mM -tól 3 mM -ig terjedő reakciókoncentrációval végezzük a koncentrációt²⁺ koncentráció minden sablon és primer esetében.

A-4 dNTP

——A dNTP -k koncentrációja túl magas —- Csökkentse megfelelően a dNTP koncentrációját

A-5 Lángolási hőmérséklet

——Túl alacsony lágyítási hőmérséklet —- Megfelelően növelje a lágyítási hőmérsékletet

A-6 Ciklusok

——Túl sok ciklus ——Optimalizálja a ciklusszámot

K: Mennyi templát DNS -t kell hozzáadni egy 50 μl -es PCR reakciórendszerhez?

K: Hogyan lehet erősíteni a hosszú töredékeket?

Az első lépés a megfelelő polimeráz kiválasztása. A hagyományos Taq polimeráz nem képes lektorálni a 3'-5 'exonukleáz aktivitás hiánya miatt, és az eltérés nagymértékben csökkenti a fragmensek kiterjesztési hatékonyságát. Ezért a hagyományos Taq polimeráz nem képes hatékonyan felerősíteni az 5 kb -nál nagyobb célfragmentumokat. A speciális módosítást tartalmazó Taq polimerázt vagy más nagy pontosságú polimerázt kell választani a kiterjesztési hatékonyság javítása és a hosszú fragmentum amplifikáció igényeinek kielégítése érdekében. Ezen túlmenően, a hosszú fragmensek amplifikálása megköveteli a megfelelő primer kialakítást, denaturálási időt, hosszabbítási időt, puffer pH-t stb. A sablon károsodásának megelőzése érdekében a denaturálódási időt 94 ° C -on ciklusonként 30 másodpercre vagy kevesebbre kell csökkenteni, és a hőmérséklet 94 ° C -ra történő felemelkedésének ideje az amplifikáció előtt kevesebb, mint 1 perc. Ezenkívül, ha a kiterjesztési hőmérsékletet körülbelül 68 ° C -ra állítja, és a meghosszabbítási időt 1 kb/perc sebességnek megfelelően tervezi, akkor biztosíthatja a hosszú fragmensek hatékony amplifikációját.

K: Hogyan lehet javítani a PCR amplifikációs pontosságát?

A PCR -amplifikáció hibaaránya csökkenthető különböző DNS -polimerázok nagy pontosságú használatával. Az összes eddig megtalált Taq DNS -polimeráz közül a Pfu enzim a legalacsonyabb hibaarányú és a legnagyobb hűségű (lásd a mellékelt táblázatot). Az enzimszelektálás mellett a kutatók tovább csökkenthetik a PCR mutáció sebességét a reakciókörülmények optimalizálásával, beleértve a puffer összetételének optimalizálását, a hőstabil polimeráz koncentrációját és a PCR ciklusszám optimalizálását.

Írja ide üzenetét, és küldje el nekünk